实验器材
- 实验器具：单道移液枪（2-5ml，100-1000μl，20-200μl，5-50μl，0.1-2.5μl） 摇床 暗盒 杂交盒 50ml 试管 2ml EP管 冰盒
- 1×PBST 1升10×PBS+9升水+10ml吐温
- 牛奶 光明脱脂奶粉 25g+500ml的1×PBST
- 丽春红染色液 膜
实验步骤
1、操作
1.1 膜的活化 在膜上标记好线（如裂解液要剪的线，裂解液 、IP的道）。
1.2 用镊子夹住膜的边缘，放到铁盒里，膜面朝上。倒上PBST溶液，水平放在摇床上摇5min。
1.3 关闭摇床，倒尽PBST，注意不要将膜倒出来。加入10ml的无水甲醇溶液。调整转速，摇1min。
1.4 关闭摇床，倒出甲醇溶液，加入1/3的PBST，摇床摇5min，重复2次。
2、封闭
2.1 完成膜的活化和清洗后，关闭摇床，倾斜倒出PBST溶液，不要将膜倒出来。
2.2 加入20ml的牛奶（牛奶使用前摇一下混匀防止沉淀），要保证膜完全在牛奶里。水平放到摇床上摇1h，调节转速为80rpm。
3、一抗稀释
3.1 取出样品置于冰盒上，稀释时样品贴壁加到牛奶中，一定保证样品加到牛奶中。
3.2 杂交盒子 每张膜10ml稀释完混匀后倒入盒子里
4、二抗
4.1 稀释二抗 ，每张膜10ml。混匀，摇床上摇30min。
5、洗膜用PBST洗膜，3次，每次10min。
6、显色Sloution A (1ml) + Sloution B(25μl)混匀，每张膜1ml。
6.1 将PVDF膜平整的铺于带有荧光标签的塑料垫板上，保持带有蓝色marker的一面朝上。
6.2 在EP管中按照显色液的配制比例配好显色液，盖上EP管盖，颠倒管子使显色液混匀。
6.3 使用200-1000μl的移液枪吸取1ml的显色液均匀的滴到PVDF膜上。用镊子将膜翻转过来，使带marker蓝色条带的一面与显色液均匀接触。
6.4 计时5min后，将膜翻转，保持带有marker的一面朝上，使用滤纸吸去显色液。
6.5 迅速撕取一张保鲜膜平铺于垫板上。保持膜与保鲜膜之间无皱褶。
7、曝光
7.1 将包好的膜放在暗盒里，打开荧光灯，调节灯光的强弱，以膜上的亮度来确定曝光的时间。通常曝5min，压上4张胶片。
7.2 5min后，取出胶片，一张一张的放到显影液中，显影一分钟（这时可更据显影的结果看是否重新压片，如曝的深的可减少曝光时间，浅的可延长曝光时间）
7.3 显影后，取出胶片放自来水下冲洗一遍，放到定影液中定影。要等到定影完全后才能取出胶片，否则容易见光导致胶片报废。