实验准备

裂解缓冲液: 1% Triton X-100

Protease inhibitor cocktail

Ca2+/Mg2+-free PBS, pH 7.4

1. 过表达的细胞裂解液制备

1.1 从细胞组得到离心好的过表达细胞沉淀(每个样品需1X10⁶个细胞).

1.2 用冰浴过的PBS悬浮细胞, 4°C, 500Xg离心5分钟,弃上清. 重复本步骤一次.

1.3 加入冰浴过的裂解液(每10⁷个细胞加入1ml裂解液), 用移液枪吹打混匀细胞,针头剪切3次(中间摇晃混匀细胞一到两次)

1.4 将裂解液超速离心(4°C, 14000Xg, 15分钟)后,迅速将上清转移到新的EP离心管中.

1.5 测上清中的蛋白含量

2.1 将细胞裂解液用PBS稀释成总蛋白含量为1mg/ml.

2.2 按血清样品号标记EP管 (另标记3个EP对照管: 阴性对照1为未过表达的细胞裂解液; 阴性对照2为阴性上清; 阳性对照为tag抗体)

2.3 于每个EP管中加入100ml细胞裂解液 (阴性对照1管中加入500ml未过表达的细胞裂解液)

2.4 取5ml纯化抗体样品加入相对应的EP管中(阴性对照2管中不加; 阳性对照管中加入5ml tag抗体)

2.5 将EP管于4°C摇动孵育过夜

2.6 在每个EP管中加入30ml 的50% Protein A/G agarose bead slurry, 继续孵育1.5小时

2.7 将EP管离心(5000rpm, 1分钟),去上清收集beads.

2.8 加入1ml裂解缓冲液悬浮EP管中的beads, 离心(1000Xg, 1分钟),去上清. 重复本步骤两次.

2.9 于每个EP管中加入10ml 3X的SDS-PAGE样品缓冲液, WB对照加入4ul6 X的SDS-PAGE样品缓冲液，轻轻吹打混匀

2.10 将以上样品100°C煮10分钟

2.11 离心(500Xg, 1分钟),将上清转移到新标记好的EP管中.

2.12 样品电泳转膜，western 验证

3.1 以上EP管中的IP样品用10孔SDS-PAGE胶电泳(胶浓度依目标蛋白大小确定), 每孔上样10ml. (电泳SOP参照电泳转膜组)

3.2 用tag抗体做WB检测(SOP参照tag抗体的WB检测).